原代細(xì)胞的培養(yǎng)

原代細(xì)胞的培養(yǎng)是指直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)。因此，較為嚴(yán)格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實(shí)際上，通常把di一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。 [1] 常用的原代細(xì)胞的培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。組織塊培養(yǎng)是將剪碎的組織塊直接移植在培養(yǎng)瓶壁上，加入培養(yǎng)基后進(jìn)行培養(yǎng)。分散細(xì)胞培養(yǎng)大致步驟為：將動物組織從機(jī)體中取出離散成單個細(xì)胞(常用胰蛋白酶)，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖(注意整個過程無菌)。

原代培養(yǎng)是直接從生物體獲取細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。由于細(xì)胞剛剛從活體組織分離出來，故更接近于生物體內(nèi)的生活狀態(tài)。這一方法可為研究生物體細(xì)胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段，同時也為以后傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件。利用此方法還可直接服務(wù)于臨床實(shí)踐。例如，用從手術(shù)中切除的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，然后用該培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行抗癌藥物的篩選，根據(jù)腫瘤細(xì)胞對加入的化療藥物的敏感性來幫助選擇有效的化療方案，有可能起到增強(qiáng)療效、降低副作用的作用。

原代細(xì)胞的復(fù)蘇

1.取出細(xì)胞，迅速放入37℃溫水中快速解凍。

2.吸出細(xì)胞懸液，并加10倍以上培養(yǎng)液。

3.用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后接種培養(yǎng)瓶，放入37℃ CO2 培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

原代細(xì)胞的培養(yǎng)其實(shí)與細(xì)胞系的培養(yǎng)無多大差別，針對不同的細(xì)胞會選擇不同的細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.培養(yǎng)液選擇 

根據(jù)不同的細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn) 要求進(jìn)行培養(yǎng)液的選擇，常用的L/H DMEM, F12 DMEM, RPMI 1640。

加液：培養(yǎng)液不能浸沒組織塊，避免組織漂浮。然后培養(yǎng)4h左右加培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后換液。

a.培養(yǎng)時間

無論是酶消化法還是組織塊法，取樣后培養(yǎng)時間最少需要一周以 上的時間，期間可換液或者傳代。

b.換液時間

無論酶消化法還是組織塊法，在培養(yǎng)期間需要隨時關(guān)注細(xì)胞的生長狀況，需觀察其是否貼壁，是否污染，組織塊法要觀察是否有細(xì)胞遷移出來。正常情況下48~72h可換液一次。

2.細(xì)胞狀態(tài)判斷

正常貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)幾天后，會逐漸貼滿整個瓶底或者皿底，有的呈纖維狀，有的呈多邊形。下圖均為比較健康的原代

原代細(xì)胞的傳代、保存

傳一代后的細(xì)胞(也可以不傳代直接凍存)培養(yǎng)至80%~90%便可凍存起來供后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。

凍存液配制:不同的細(xì)胞可能會有不同的凍存液配制方案，各實(shí)驗(yàn)室也有自己的凍存方案，常見的方案有:

A: 10%DMSO+90%FBS

B: 10%DMSO+40%FBS+50DMEM

C: 5%DMS0+45%DMEM+50%FBS 

按下列順序降溫：室溫→4℃(20分鐘)→冰箱冷凍室(30分鐘)→超低溫冰箱(-80℃ 過夜)→液氮。

D：無血清凍存液

傳代：依椐細(xì)胞的生長狀態(tài)，生長的細(xì)胞1：2或1：3進(jìn)行傳代。

細(xì)胞培養(yǎng)過程無菌操作

正常的復(fù)蘇，換液和傳代操作，最后將培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)即可